Knockout vincenti: come l’espansione dei CAG guida la malattia

La malattia di Huntington (HD) è causata da ripetizioni extra delle lettere del DNA CAG all’interno del codice genetico del gene huntingtina. Un tempo pensavamo che quelle lunghezze di CAG fossero stabili nella maggior parte dei tessuti, ma ora abbiamo una crescente comprensione che l’instabilità dei CAG contribuisce alla HD. L’instabilità somatica è il concetto secondo cui le ripetizioni CAG si espandono nel tempo in alcuni tipi di cellule, in particolare le cellule vulnerabili nella HD. Molti scienziati pensano che questo processo possa giocare un ruolo nell’accelerare lo sviluppo dei sintomi.

Un articolo attuale approfondisce alcuni dei meccanismi dietro questo fenomeno, chiedendosi come l’espansione dei CAG sia collegata alla malattia e come la scienza potrebbe sfruttare i geni di riparazione del DNA come trattamento per la HD.

Dalle persone agli animali… e di nuovo alle persone

La nostra attuale comprensione del fenomeno dell’espansione delle ripetizioni CAG deriva da vasti studi sull’uomo in cui i partecipanti con HD hanno donato campioni e dati clinici. I loro contributi hanno permesso agli scienziati di collegare sottili differenze nella genetica delle persone con l’età in cui hanno sviluppato i sintomi della HD. Questi studi, noti come studi di associazione genome-wide, o GWAS, (pronunciato ‘gee-wass’) hanno mostrato che certe variazioni del DNA potrebbero accelerare o ritardare notevolmente l’insorgenza della HD.

Molti dei geni identificati in questi studi che hanno richiesto ulteriori ricerche appartengono a una famiglia di geni che aiutano a riparare il DNA. Gli ultimi anni hanno visto un’intensa attività che ci ha portato a nuove conclusioni sulla HD e sull’espansione dei CAG. Ecco un breve riepilogo prima di immergerci in alcuni dati nuovi su questo argomento:

• Il meccanismo di riparazione del DNA può commettere errori quando cerca di “correggere” ripetizioni CAG extra-lunghe – rendendole accidentalmente sempre più lunghe!

• Questo non accade nella stragrande maggioranza delle cellule, ma sembra verificarsi molto in una parte del cervello chiamata striato, che controlla l’umore, il movimento e la motivazione. Studiare l’espansione dei CAG nello striato potrebbe avvicinarci alla comprensione del perché queste cellule siano così vulnerabili nella HD.

• Alcuni studi hanno scoperto che esiste una soglia di circa 150 ripetizioni CAG oltre la quale il danno alla cellula inizia ad accelerare.

• Il “knockout” sperimentale o la rimozione genetica dei geni di riparazione del DNA noti per commettere errori sui CAG può rallentare o addirittura arrestare l’espansione delle ripetizioni CAG nei modelli di laboratorio della HD.

• Alcuni di questi geni, come Msh3, sono bersagli di terapie umane per la HD in fase di sviluppo – ma dobbiamo ancora capire meglio come influenzano la biologia della HD e quali siano le conseguenze (positive e negative) del loro knockout.

Impostazione dell’esperimento

Gli autori di un recente articolo, guidati da X. William Yang dell’Università della California, Los Angeles (UCLA), hanno adottato un approccio diretto e approfondito per esplorare la connessione tra geni di riparazione del DNA, espansione dei CAG, salute delle cellule cerebrali e persino il comportamento.

Hanno scelto un set di nove geni identificati negli studi GWAS sull’uomo e che fanno parte del meccanismo che esegue un certo tipo di riparazione del DNA, il tipo che guida l’“errore” dell’allungamento dei CAG. Poi hanno utilizzato la genetica murina specializzata e schemi di allevamento per creare topi HD privi di una o entrambe le copie di questi geni di riparazione del DNA.

In ciascuno di questi topi HD, mancando geni come Msh3, Pms1, Mlh1 e altri, hanno potuto imparare di più su come l’interferenza con la riparazione del DNA potesse influenzare l’espansione dei CAG, la produzione di messaggi RNA (la specialità del laboratorio), l’accumulo di huntingtina tossica e altre caratteristiche della HD. Sono rimasti sorpresi di apprendere che alcuni knockout avevano profonde conseguenze positive, mentre altri non avevano alcun effetto. Ciò che hanno imparato è prezioso per la nostra comprensione della biologia della HD e lo sviluppo di terapie.

Invertire i cambiamenti dell’RNA

Il nostro DNA viene letto o “trascritto” da meccanismi specializzati per produrre messaggi RNA, che vengono infine utilizzati per produrre proteine, i mattoni della vita. Esiste un intero ramo della scienza che esplora la posizione e la quantità di messaggi RNA prodotti da geni diversi – questo è il campo della trascrittomica.

Gli scienziati possono definire un “trascrittoma” di topo sano esaminando migliaia di geni e chiedendosi quali siano normalmente attivati e disattivati in diverse cellule, e quanta quantità di ciascun messaggio RNA sia presente. Poi possono osservare come questo cambia in un topo HD nel tempo, o sperimentare per vedere cosa potrebbe aiutare a ripristinare i livelli di RNA del topo alla normalità.

Il laboratorio Yang stava lavorando con un tipo di topo che modella la HD e che mostrava importanti cambiamenti nel suo trascrittoma rispetto ai topi normali. Molti geni producono più o meno RNA di quanto dovrebbero, specialmente all’interno dei neuroni spinosi medi, le cellule più vulnerabili nella HD. Quando il laboratorio Yang ha “eliminato” metà di Msh3 e Pms1 nel loro modello di topo HD, hanno osservato un’inversione parziale dei cambiamenti dell’RNA nei neuroni spinosi medi. Con Msh3 o Pms1 completamente assenti, i cambiamenti dell’RNA sono stati quasi completamente invertiti, spesso durando fino a un anno (metà della vita di un topo da laboratorio!). L’eliminazione di un paio di altri geni – Msh2 e Mlh1 – ha avuto anche alcuni effetti di inversione, ma questi erano più moderati. Alcuni knockout genici non hanno avuto alcun effetto.

I membri del laboratorio Yang sono esperti mondiali nello studio della trascrittomica della HD e hanno utilizzato molteplici tecniche di laboratorio all’avanguardia, oltre a diversi approcci statistici per confermare i loro risultati. Hanno esaminato i livelli di RNA in molte cellule, fino al livello di singole cellule, e hanno anche osservato quanto strettamente il DNA fosse avvolto attorno al suo “rocchetto”, noto come cromatina. In tutti i casi, il knockout di Msh3 e Pms1 sembrava invertire i cambiamenti legati alla HD.

Stabilizzare i CAG e gli aggregati

In parallelo, il laboratorio Yang ha misurato la quantità di instabilità somatica – l’allungamento delle ripetizioni CAG – in diverse parti del cervello e del corpo. In questo tipo di topo HD, le ripetizioni CAG si allungano nel tempo, specialmente all’interno delle cellule dello striato. Infatti, questo gruppo ha usato la statistica per definire il tasso al quale i CAG si espandono in queste cellule cerebrali murine vulnerabili: è di circa 8,8 ripetizioni CAG al mese. (Questi tassi di espansione NON si applicano agli esseri umani – questi topi iniziano con 140 ripetizioni e sono progettati per la sperimentazione.)

La scoperta entusiasmante è che quando i topi avevano meno o nessun Msh3 o Pms1, quel tasso diminuiva notevolmente. Infatti, la rimozione di entrambe le copie di Msh3 ha rallentato quel tasso a 0,3 ripetizioni CAG extra al mese, fino a 20 mesi di età – il che è fondamentalmente una lunghezza di ripetizione stabile, in un topo anziano!

Allo stesso tempo, Yang e colleghi hanno osservato che i topi HD con metà o nessun Msh3 o Pms1 avevano anche molti meno aggregati di proteina huntingtina nello striato. L’accumulo di questi aggregati è una caratteristica classica della HD che molti scienziati sospettano possa essere tossica per le cellule cerebrali. La rimozione di Msh3 ha prevenuto la formazione di aggregati di huntingtina anche in altre aree del cervello. La quantità di huntingtina aggregata sembrava corrispondere alla quantità di cambiamenti anomali dell’RNA che avevano precedentemente osservato.

Inoltre, sono stati in grado di confermare risultati di altri laboratori mostrando che sembra esserci una soglia di ripetizioni CAG – circa 150 – al di sopra della quale la cellula inizia a sperimentare più stress. Hanno collegato questa soglia a livelli più elevati di cambiamenti dell’RNA: l’espansione dei CAG accelera e peggiora quello stress.

Prevenire i cambiamenti cerebrali e comportamentali

Amiamo la matematica e i grafici a pannelli multipli arcobaleno, ma è ancora più interessante vedere un legame tra genetica e salute comportamentale. Un modo in cui questo lavoro rappresenta un passo avanti è che gli autori mostrano come il knockout dei geni che prevengono l’espansione dei CAG possa anche avere effetti sulle cellule cerebrali e sul movimento dei topi.

Questo tipo di topo HD tende a mostrare cambiamenti nelle connessioni tra i neuroni, note come sinapsi, così come un ingrossamento delle cellule di supporto chiamate astrociti. I topi hanno anche problemi con la loro andatura e il movimento. Tuttavia, quando i ricercatori hanno eliminato Msh3, non hanno più osservato nessuno di questi cambiamenti legati alla HD nei topi. Questa è un’ulteriore prova del ruolo di Msh3 nella HD e suggerisce che è un buon bersaglio farmacologico.

Si noti che questo non era un focus principale dell’articolo – hanno esaminato solo alcune caratteristiche della salute cerebrale e un compito comportamentale – ma è comunque un legame promettente.

Piccoli passi alimentano i trattamenti futuri

Avrete probabilmente notato che HDBuzz ha insistito sull’instabilità somatica (a gran voce e frequentemente) da un po’ di tempo, e che abbiamo presentato molti messaggi simili: l’espansione delle ripetizioni CAG sembra contribuire alla HD, e gli scienziati hanno identificato alcuni modi per combatterla. Questo lavoro non fa eccezione; ancora una volta, geni come Msh3 e Pms1 sono i colpevoli che possono essere “eliminati” con grande beneficio nei cervelli di un tipo di topo HD.

Tutti questi progressi individuali possono sembrare piccoli, ma pubblicazioni come questa rappresentano anni di lavoro collaborativo tra un grande team, plasmato da frequenti contributi di una comunità internazionale di scienziati della HD. Abbiamo scelto di evidenziare questo particolare articolo perché collega l’espansione dei CAG, i messaggi RNA anomali e i cambiamenti nella salute e nel comportamento del cervello.

Gli autori avvertono che abbiamo bisogno di molte più informazioni per comprendere veramente il legame tra Msh3 e Pms1 e i sintomi della HD. Riconoscono anche, come facciamo sempre, che i topi non sono persone. Questi topi in particolare iniziano la vita con 140 CAG in ogni cellula del loro corpo, il che è molto più alto della maggior parte dei casi di HD giovanile umana. Le ripetizioni CAG non si espandono negli esseri umani con la stessa rapidità con cui lo fanno in questi topi sperimentali.

Tuttavia, i loro dati, insieme a quelli di altri laboratori che lavorano instancabilmente per comprendere la HD, costituiscono un forte argomento per lo sviluppo di terapie basate su Msh3 e Pms1. E questi sforzi sono effettivamente in corso!

Per saperne di più

• Geni distinti del complesso di riparazione del disallineamento determinano il tasso di espansione delle ripetizioni CAG neuronali per guidare la patogenesi selettiva nei topi HD (accesso aperto)