Importanti progressi negli strumenti di editing del genoma di nuova generazione per la malattia di Huntington

Negli ultimi giorni sono emerse numerose notizie sull’uso di una tecnica chiamata editing del genoma come potenziale terapia per malattie genetiche come la malattia di Huntington. Questi approcci, che includono strumenti dal suono esotico come le nucleasi a dita di zinco e CRISPR/Cas9, differiscono dai modi più tradizionali di ridurre l’impatto della mutazione HD sulle cellule. Cosa c’è di nuovo in questo entusiasmante campo di ricerca?

Aggiornamento sulla riduzione dell’huntingtina

Recentemente c’è stato molto entusiasmo per l’avanzamento di un nuovo trattamento di riduzione dell’huntingtina, a volte chiamato silenziamento genico, per la malattia di Huntington. Il primo di questi farmaci a raggiungere gli studi clinici sull’uomo per l’HD, chiamati oligonucleotidi antisenso (ASO), riduce la quantità di proteina huntingtina mutante dannosa che viene creata da una cellula e, in definitiva, limita il danno che può causare.

Coloro che ci seguono sanno che è attualmente in corso il primo studio di valutazione della sicurezza degli ASO in pazienti umani con HD (http://en.hdbuzz.net/204), ma alcuni lettori potrebbero anche ricordare che gli ASO non sono gli unici protagonisti quando si tratta di modi innovativi per ridurre la proteina huntingtina dannosa.

Infatti, altre due nuove tecniche terapeutiche note come nucleasi a dita di zinco e CRISPR hanno suscitato un certo interesse di recente. Sebbene abbiamo già trattato entrambi questi approcci (http://en.hdbuzz.net/023), una rapida revisione del loro funzionamento e delle differenze tra loro sarà utile per comprendere alcune nuove scoperte.

Probabilmente ricorderai dalle tue prime lezioni di biologia che il tuo DNA fornisce una serie dettagliata di istruzioni su come costruire, beh, te stesso! Ogni cellula del tuo corpo è molto simile a un cantiere edile e il tuo DNA è il progetto principale con le istruzioni per prendere i mattoni più elementari (chiamati amminoacidi) e trasformarli in proteine funzionanti che contribuiscono a tutte le tue caratteristiche uniche e assicurano che le cose nel tuo corpo continuino a funzionare senza intoppi.

Chiamiamo le istruzioni del DNA per la costruzione di proteine specifiche geni e ognuno di noi ha due copie del gene per la produzione di un’importante proteina chiamata huntingtina. I sintomi associati alla malattia di Huntington si verificano perché una di queste serie di istruzioni genetiche ha sviluppato un errore di stampa che fa sì che la proteina huntingtina venga costruita in modo improprio. Nella stragrande maggioranza dei pazienti con HD, questo porta a due tipi di proteina huntingtina: una proteina huntingtina mutante che non funziona più correttamente e una proteina huntingtina sana che invece funziona.

Mettiamoci al lavoro…

All’interno di ciascuna delle cellule del tuo corpo, il tuo DNA è immagazzinato e protetto in profondità in una posizione chiamata nucleo, proprio come il progetto principale di un edificio che è stato chiuso a chiave dal direttore dei lavori nel suo ufficio per evitare che venga danneggiato.

In un vero cantiere edile, sarebbe molto lento e inefficiente se ogni lavoratore dovesse recarsi nell’ufficio del direttore dei lavori per utilizzare lo stesso set di istruzioni durante la costruzione, e a quanto pare lo stesso vale per le nostre cellule.

Per evitare questo problema, viene realizzata una copia di lavoro delle istruzioni che viene utilizzata come modello per la costruzione di proteine. Questa copia di lavoro è chiamata RNA messaggero, o mRNA, e viene copiata dal DNA originale e inviata nella cellula dove viene utilizzata per costruire molte copie delle stesse proteine su una scala più ampia.

Se il nostro DNA è come il progetto principale originale, allora l’mRNA è molto simile alle singole copie del progetto che vengono consegnate dal direttore dei lavori alla sua squadra in modo che possano iniziare a costruire in modo efficiente. Questo potrebbe sembrare confuso, ma ai nostri fini tutto ciò che devi sapere sono i tre passaggi coinvolti nella costruzione di una proteina: DNA -> mRNA -> proteina.

ASO, dita di zinco e CRISPR: stesso obiettivo, mezzi diversi

È importante fare la distinzione tra il gene HD nel DNA e nell’mRNA perché sono presi di mira in modo diverso dalle terapie di riduzione dell’huntingtina in rapido sviluppo. Queste includono una serie di tecniche diverse come ASO, dita di zinco e un nuovo approccio chiamato CRISPR/Cas9. Fondamentalmente, tutte queste tecniche terapeutiche hanno lo stesso obiettivo in mente: ridurre la quantità di proteina huntingtina mutante dannosa prodotta in una cellula, ma raggiungono questo obiettivo in modi molto diversi.

Delle tre opzioni, gli ASO sono in circolazione da più tempo, il che potrebbe non sorprenderti dato che sono emersi come i primi ad essere valutati in pazienti umani con HD. Gli ASO funzionano dicendo alle cellule di sparare al messaggero, in questo caso l’intermedio di mRNA che trasporta le istruzioni dal DNA per produrre una proteina. In una cellula trattata, i farmaci ASO si attaccano letteralmente all’mRNA che fornisce le istruzioni per la produzione della proteina huntingtina mutante dannosa e convincono la cellula a tagliarla in modo che la proteina non possa più essere prodotta.

Molti scienziati e membri della comunità HD sono molto entusiasti dei progressi della terapia ASO come opzione di trattamento per l’HD, ma resta il fatto che la terapia ASO non ha come bersaglio la causa ultima dell’HD (il gene HD difettoso codificato nel DNA di una persona) e rimane un passo indietro prendendo di mira l’mRNA. Poiché il gene mutante è ancora presente nel DNA, l’mRNA e la proteina mutanti continuerebbero a essere prodotti nelle cellule trattate con ASO. Ciò significa, per quanto ne sappiamo oggi, che il trattamento con ASO dovrebbe essere continuato per tutta la vita.

A differenza della riduzione dell’huntingtina mediante ASO, le nuove tecniche, tra cui le nucleasi a dita di zinco e CRISPR/Cas9, sono entrambe una forma di tecniche di editing del genoma. Questi incredibili nuovi strumenti consentono agli scienziati di prendere di mira la fonte ultima del problema nell’HD, lo stesso DNA mutante. Questi strumenti consentono agli scienziati di prendere di mira con precisione una posizione specifica nel DNA (come le istruzioni per la produzione della proteina huntingtina) e quindi eseguire una serie di trucchi utili.

Uno di questi trucchi che possono fare è quello di fungere da una sorta di segnale di stop per la cellula. Quando il macchinario che normalmente legge il DNA arriva al gene HD mutante, gli strumenti di editing del genoma progettati in modo appropriato possono richiamarli, dicendo loro di non fare il loro lavoro su quel gene preciso. Ciò si traduce nella mancata produzione di mRNA o proteina huntingtina mutante. Si noti che questo è diverso dal modo in cui funzionano gli ASO, che consiste nel degradare l’mRNA che è già stato prodotto.

Un importante nuovo strumento di editing del genoma chiamato CRISPR/Cas9 ha recentemente entusiasmato molte persone. Questi strumenti, presi in prestito da alcune specie batteriche che li usano come una sorta di sistema immunitario, consentono alle cellule di inserire sequenze di DNA estraneo nel proprio DNA. Esseri umani davvero intelligenti hanno preso quegli strumenti dai batteri e li hanno riprogettati per consentire agli scienziati di effettuare tagli precisi nel DNA in sequenze specifiche.

In teoria, e in laboratorio, le tecniche CRISPR possono essere utilizzate per tagliare sequenze di DNA specifiche in modo che la cellula non possa più leggere un gene. Possono anche essere utilizzate per indirizzare le cellule a apportare modifiche specifiche alle sequenze di DNA, anche, in teoria, riparando mutazioni come quelle che causano l’HD. Prendere di mira la causa dell’HD alla radice (il gene HD) garantirebbe che sia l’mRNA huntingtina mutante che la proteina huntingtina mutante non vengano più prodotti e non possano più causare danni.

La sicurezza prima di tutto!

Se ti stai chiedendo perché non stiamo già testando questi nuovi strumenti come farmaci, è perché molte cose devono accadere nella pipeline di sviluppo dei farmaci per assicurarsi che il prodotto finale sia sicuro ed efficace prima che possa essere testato nei pazienti con HD.

Innanzitutto, gli scienziati devono capire come far arrivare questi farmaci al cervello dove la proteina huntingtina mutante fa la maggior parte dei suoi danni. Questo è difficile: il nostro cervello è particolarmente bravo a tenere fuori le cose che potrebbero essere dannose e, sfortunatamente, non sta per dare a questi farmaci un lasciapassare gratuito. Se provassimo a metterli in una pillola o a iniettarli nel nostro sangue, i nostri corpi li distruggerebbero e li renderebbero inutili molto prima che raggiungano il cervello.

Poiché gli ASO sono in circolazione da un po’ più di tempo, gli scienziati hanno avuto un po’ di tempo in più per affrontare questo problema, anche se la loro soluzione è ancora tutt’altro che perfetta. Gli ASO utilizzati nello studio umano sull’HD devono essere iniettati nel fluido che bagna il cervello e il midollo spinale, il liquido cerebrospinale. Abbiamo tutte le ragioni per credere che questo funzionerà, ma è ovviamente più complicato che semplicemente ingoiare una pillola.

Gli strumenti di editing del genoma come CRISPR e dita di zinco sono ancora più complicati da fornire rispetto alle loro controparti ASO. Questo perché sono effettivamente proteine stesse e queste sono difficili da fornire intatte alle cellule.

Per aggirare questo problema, i ricercatori utilizzano virus innocui per fare l’autostop con le istruzioni del DNA per la produzione di queste proteine nelle cellule cerebrali. Da lì, le cellule vengono indotte a utilizzare lo stesso macchinario che usano per costruire le proprie proteine per costruire strumenti di editing del genoma, trasformando essenzialmente le cellule in fabbriche per i propri farmaci!

Cosa c’è di nuovo con le dita di zinco per l’HD?

Non essendo persone che si tirano indietro di fronte a una buona sfida, molti team di ricerca hanno lavorato duramente per affrontare i problemi menzionati in precedenza per fare progressi verso l’applicazione di queste nuove tecniche all’HD. In precedenza, HDBuzz aveva riferito che un gruppo di ricercatori spagnoli aveva testato un nuovo farmaco a dita di zinco che mostrava alcuni effetti benefici in un modello murino di HD in uno studio a breve termine (http://en.hdbuzz.net/103).

Recentemente, lo stesso team di ricerca, guidato da Mark Isalan, che ora risiede all’Imperial College di Londra, nel Regno Unito, ha progettato e testato una versione aggiornata del proprio farmaco per vedere se potevano migliorarne gli effetti per un periodo di tempo più lungo e ridurre la dannosa risposta immunitaria nel cervello associata alla somministrazione del farmaco mediante AAV.

Dopo alcune intense modifiche biochimiche, Isalan e i suoi colleghi sono stati in grado di dimostrare che il loro nuovo e migliorato candidato a dita di zinco era più efficace della loro versione precedente nel ridurre la proteina huntingtina mutante dannosa, era più duraturo, era più selettivo nel prendere di mira solo il gene HD e mostrava un profilo di sicurezza molto migliore rispetto alla loro versione precedente.

Queste sono scoperte davvero entusiasmanti e tutti passi avanti positivi per rendere la terapia con dita di zinco un’opzione praticabile per il trattamento dell’HD umano! Questo lavoro lento e paziente con le dita di zinco è simile a quello che è successo con i farmaci ASO, che hanno avuto un vantaggio di molti anni sugli strumenti di editing del genoma.

E per quanto riguarda CRISPR?

Pur essendo considerata il modo più preciso per condurre l’editing del genoma, la tecnologia CRISPR è ancora l’ultima arrivata e gli scienziati hanno avuto molto meno tempo per risolvere i problemi rispetto alle altre tecniche.

In un entusiasmante progresso nell’utilizzo di CRISPR come opzione terapeutica nell’HD, un team di ricercatori guidato da Jong-Min Lee al Massachusetts General Hospital ha recentemente sviluppato un costrutto CRISPR in grado di modificare selettivamente la copia mutante, ma non di tipo selvatico, del gene HD nelle cellule in una piastra. Sfruttando la capacità di targeting altamente specifica di CRISPR, sono stati in grado di istruire le cellule trattate a tagliare il gene HD mutante, lasciando intatta la copia sana.

Naturalmente, una cosa è dimostrare che un farmaco è efficace sulle cellule in una piastra e un’altra cosa è dimostrare che può essere efficace se testato in un organismo vivente. Questo è particolarmente vero con tecniche come CRISPR: per quanto ne sappiamo oggi, abbiamo bisogno di un virus per trasportare le istruzioni a ciascuna delle nostre 100 miliardi di cellule cerebrali per salvarle dagli effetti del gene HD mutante.

Un altro rischio è che CRISPR e altri strumenti di editing del genoma modifichino il DNA in modo permanente. Questo è diverso dai farmaci come gli ASO che vengono alla fine eliminati dal cervello, il che significa che i loro effetti svaniscono nel tempo se non vengono somministrati di nuovo.

All’inizio, questa idea sembra fantastica! Se potessimo curare l’HD con un solo trattamento, ci piacerebbe sicuramente poterlo fare. Tuttavia, non siamo ancora sicuri degli effetti a lungo termine associati all’eliminazione permanente del gene HD e alla riduzione della quantità di proteina huntingtina che viene creata, indipendentemente dal fatto che sia mutante o meno. Esiste la possibilità che l’eliminazione permanente del gene HD possa portare alla comparsa successiva di alcuni gravi problemi di salute di una varietà diversa e dovremo dedicare un tempo considerevole allo studio dei suoi effetti prima di sapere se sarà sicuro.

Quali sono i prossimi passi?

C’è ancora molto lavoro da fare prima che le tecniche di editing del genoma come le dita di zinco e i trattamenti CRISPR diventino opzioni praticabili per la malattia di Huntington, ma la ricerca qui presentata mostra che abbiamo compiuto alcuni passi importanti verso il raggiungimento di questa impresa.

Mentre il recente lavoro mostra che la terapia con dita di zinco è efficace in un modello murino di HD, il cui cervello è più piccolo di una monetina, sarà molto più difficile dimostrare che può essere efficace negli esseri umani, il cui cervello è molto più grande, più complesso e presenta molte altre sfide da superare. La terapia CRISPR richiederà probabilmente ancora più tempo, poiché solo ora stiamo arrivando al punto in cui possiamo pianificare di testarne l’efficacia nei modelli murini di HD.

Tuttavia, questo non è motivo di scoraggiamento e, anzi, pensiamo che sia vero il contrario! La parte più entusiasmante della ricerca attuale è che mostra che abbiamo molte frecce nel nostro arco mentre cerchiamo di sviluppare un trattamento di riduzione dell’huntingtina per l’HD. Anche se si scoprisse che un’opzione non funziona come speravamo, stiamo facendo progressi costanti nello sviluppo di nuove terapie che potrebbero anche fornire trattamenti efficaci per l’HD.

Questa idea è una di quelle che molti stanno iniziando a capire rapidamente: recentemente due aziende farmaceutiche, Sangamo Biosciences e Shire Pharmaceuticals, hanno unito le forze per accelerare i loro sforzi nello sviluppo del trattamento con dita di zinco come opzione terapeutica per la malattia di Huntington. Anche se ci vorrà un po’ di tempo per risolvere i problemi, immaginiamo che sarà solo questione di tempo prima che lo stesso valga per CRISPR. Personalmente, pensiamo che i progressi compiuti finora ci diano molti motivi per essere entusiasti!

Per saperne di più

• Studio originale di Lee e colleghi che descrive la silenziatura specifica del gene HD mutante utilizzando CRISPR in cellule di pazienti HD. (l’articolo completo richiede il pagamento o l’abbonamento)
• Studio originale di Isalan e colleghi che descrive il loro lavoro di miglioramento dei trattamenti virali con dita di zinco in modelli murini HD (accesso aperto)
• Una bella animazione che descrive come CRISPR consente agli scienziati di modificare il DNA