Bloccare un frammento tossico: un nuovo studio sui topi evidenzia l’importanza di HTT1a nella malattia di Huntington

Un nuovo studio che utilizza l’editing genetico di precisione in un modello murino della malattia di Huntington (MH) fornisce la prova che un piccolo frammento della proteina huntingtina (HTT), chiamato HTT1a, è un fattore centrale della MH. Riducendo i livelli di HTT1a, i ricercatori hanno ritardato i segni della MH come l’agglomerazione proteica, hanno ripristinato l’attivazione o la disattivazione dei geni e hanno riportato i biomarcatori sotto controllo nei topi che modellano la MH. Scoprire la forma più tossica di HTT che guida la malattia potrebbe avere implicazioni importanti per il modo in cui progettiamo i farmaci per l’abbassamento della HTT.

Un rapido ripasso: ripetizioni CAG e HTT1a

Tutte le persone affette da MH presentano una modifica nel codice genetico del gene HTT. Una sequenza ripetuta di lettere del DNA C-A-G si espande fino ad avere troppe ripetizioni. Le persone con 40 o più CAG nel gene HTT svilupperanno la malattia se vivranno abbastanza a lungo, e ripetizioni più lunghe sono generalmente collegate a un esordio più precoce.

L’espansione della ripetizione CAG nel gene HTT causa una corrispondente espansione nella proteina HTT codificata, che viene prodotta a partire da queste istruzioni genetiche. Ma la ripetizione CAG non cambia solo la sequenza proteica. Influisce anche sul modo in cui viene elaborato l’intermediario tra il DNA e la proteina: l’RNA messaggero.

Una copia della ricetta genetica

L’RNA messaggero è una molecola di messaggio genetico. Viene creata come una copia fedele della sequenza di DNA codificata per un dato gene, prima di essere utilizzata per produrre la proteina codificata da questa sequenza. È un po’ come fare una copia di una ricetta da un libro per poterla cucinare senza dover consultare continuamente il libro originale.

Quando la ripetizione CAG è espansa, può attivarsi un segnale nascosto nell’RNA messaggero della HTT. Questo segnale è chiamato “polyA criptico” e dice ai macchinari cellulari di smettere di produrre la proteina HTT troppo presto. Ciò significa che invece di produrre la proteina HTT a lunghezza intera, la cellula ne produce solo un piccolo frammento, chiamato HTT1a.

HTT1a: una proteina frammento di HTT tossica

La proteina frammento HTT1a contiene la regione espansa, codificata dalla ripetizione CAG, che appare come una serie infinita dello stesso amminoacido, la glutammina. Questo frammento è altamente incline all’agglomerazione (un processo chiamato aggregazione) ed è risultato tossico in molti modelli animali e cellulari di MH.

È importante notare che più lunga è la ripetizione CAG, maggiore è la quantità di proteina frammento HTT1a prodotta. Poiché la ripetizione CAG può allungarsi in alcune cellule del corpo nelle persone con MH, un processo chiamato espansione somatica, si pensa che HTT1a sia un passaggio chiave nel modo in cui la malattia progredisce.

Per capire meglio questo aspetto, i ricercatori di questo studio si sono chiesti se l’aumento della quantità di HTT1a prodotta potesse essere il fattore che collega l’espansione somatica al danno delle cellule nervose.

Una strategia genetica intelligente: eliminare i segnali che causano il frammento

Per testare direttamente questa ipotesi, il team ha utilizzato un modello murino di MH che presenta quasi 200 CAG nel gene HTT. Si tratta di un numero di ripetizioni molto più alto di quello che si vede tipicamente nelle persone, ma questo accelera la comparsa dei sintomi nei topi, permettendo ai ricercatori di ottenere risposte ai loro esperimenti più velocemente. A causa delle peculiarità dei sistemi modello della MH, questi topi sono chiamati HdhQ150.

Utilizzando gli strumenti CRISPR, che sono come forbici genetiche, hanno eliminato una parte del gene HTT che contiene il segnale per formare il frammento HTT1a. Questo dovrebbe impedire la produzione del frammento tossico HTT1a in questi topi, anche se il numero di CAG è sufficientemente alto da spingere le cellule a crearlo. Questo nuovo tipo di modello murino di MH è stato chiamato topo HdhQ150ΔI, dove il simbolo Δ (delta) rappresenta il dominio genetico rimosso.

Hanno anche utilizzato topi con numeri di ripetizioni CAG che non causano la MH per rappresentare la popolazione generale senza la malattia. Anche per questi topi hanno rimosso il segnale di produzione di HTT1a, in modo da avere un controllo per i possibili effetti dell’editing genetico non correlati al numero di CAG. In questo modo avrebbero saputo se i risultati osservati erano dovuti all’editing CRISPR in sé o effettivamente alla mancata produzione di HTT1a.

Cosa è successo ai livelli di HTT1a in questi topi?

Come previsto, i livelli di HTT1a sono crollati nei topi HdhQ150ΔI. La molecola del messaggio RNA di HTT1a era completamente assente in questi topi e i livelli proteici erano ridotti, ma ancora rilevabili.

Ma perché si trova ancora un po’ di HTT1a? I ricercatori suggeriscono che questa eliminazione potrebbe aver portato i macchinari genetici a “leggere” il gene in modo diverso, producendo comunque la proteina HTT1a, ma in quantità molto ridotte.

È importante notare che i livelli di HTT a lunghezza intera, sia non espansa (normale) che espansa (forma MH), sono rimasti invariati. Questo è fondamentale per gli esperimenti successivi, affinché il team potesse capire quali effetti fossero dovuti specificamente alla riduzione di HTT1a e non ai livelli totali di HTT.

Un importante ritardo nell’aggregazione

Un risultato sorprendente di questo studio è stato che gli ammassi tossici di HTT, o aggregati, sono stati trovati nel cervello molto più tardi nei topi HdhQ150ΔI rispetto ai topi HdhQ150.

Nei topi HdhQ150 standard che modellano la MH, gli aggregati sono stati individuati in diverse regioni del cervello a 6 mesi di età e hanno continuato ad aumentare con l’invecchiamento dei topi. Potresti pensare: “Ehi! 6 mesi sono pochissimi!”. E avresti ragione. La rapida cronologia delle caratteristiche della MH in questi topi è causata dall’altissimo numero di ripetizioni CAG ed è intenzionale per ottenere risultati più velocemente.

Tuttavia, nei topi HdhQ150ΔI che non producevano il frammento tossico HTT1a, questi ammassi sono stati ritardati di diversi mesi e, in alcune parti del cervello, non sono stati evidenti finché i topi non sono diventati molto più vecchi. Questi ammassi contenevano ancora HTT1a, rafforzando l’idea che questo frammento di HTT sia importante per dare il via alla formazione di tali aggregati.

Effetti sull’espressione genica

Successivamente, i ricercatori hanno osservato quali geni venivano attivati e disattivati in questi diversi modelli murini. Si tratta di un cambiamento ben documentato che avviene precocemente in diversi modelli di MH, con una firma specifica di cambiamenti negli interruttori genici.

Nei topi HdhQ150 con MH, i ricercatori hanno scoperto che oltre 1.200 interruttori genici risultavano alterati a 6 mesi nello striato, una regione profonda del cervello maggiormente colpita dalla MH. A 12 mesi, si è arrivati a oltre 2.800 geni.

Nei topi con meno HTT1a, alcuni di questi interruttori genici sono stati ripristinati, con un miglioramento del 25% a 6 mesi e del 40% a 12 mesi. Quando hanno osservato un’altra parte del cervello chiamata ippocampo, hanno visto miglioramenti parziali anche lì.

È interessante notare che anche i bassi livelli residui di HTT1a nei topi HdhQ150ΔI sono stati sufficienti per iniziare a correggere questo segno distintivo della MH.

Biomarcatori: un effetto sorprendente

Forse il risultato più entusiasmante di questo studio è arrivato dai livelli dei biomarcatori che i ricercatori hanno analizzato nel plasma e nel liquido cerebrospinale che bagna il cervello, chiamato anche liquor. Il team ha misurato l’NfL, un biomarcatore generale della salute del cervello, così come BRP39, l’equivalente murino di un biomarcatore umano chiamato YKL-40 che è correlato all’infiammazione.

Nei topi HdhQ150 con MH, entrambi i biomarcatori erano aumentati nel liquor a 12 mesi, indicando che il sistema nervoso di questi topi era malato. Tuttavia, nei topi HdhQ150ΔI, NfL e BRP39 sono rimasti ai livelli dei topi normali senza MH a 12 e 17 mesi nel liquor, e sono risultati ridotti anche nel plasma.

È interessante notare che questo ritorno ai livelli normali dei biomarcatori nel liquor è avvenuto nonostante i cambiamenti nella firma degli interruttori genici fossero stati ripristinati solo parzialmente. Poiché NfL e YKL-40 possono essere utilizzati negli studi clinici sull’uomo per valutare la salute del cervello, questa scoperta suggerisce che la riduzione di HTT1a potrebbe alterare significativamente la biologia della MH.

Unire i puntini: espansione somatica → HTT1a → aggregazione

L’espansione somatica delle CAG è oggi considerata da molti ricercatori della MH come un fattore trainante della malattia. Man mano che le ripetizioni CAG si espandono nei neuroni più colpiti dalla MH, i livelli di HTT1a aumentano. Gli scienziati di questo studio propongono un modello in cui:

1. L’espansione somatica aumenta la ripetizione CAG e la produzione di HTT1a.
2. L’aumento di HTT1a porta a più ammassi tossici in queste cellule.
3. Gli ammassi guidano ulteriori cambiamenti negli interruttori genici.
4. Questo causa poi la malattia delle cellule, portando a cambiamenti nei livelli dei biomarcatori.

Propongono che questo processo possa essere rallentato o interrotto riducendo i livelli di HTT1a.

Cosa significa questo per le terapie?

Diversi approcci per l’abbassamento della HTT sono in fase di sviluppo o di sperimentazione clinica. Molti abbassano solo la forma HTT a lunghezza intera. Questi includono l’oligonucleotide antisenso (ASO) tominersen di Roche e i modulatori dello splicing a piccole molecole come votoplam e SKY-0515 rispettivamente di Novartis e SkyHawk.

Altri colpiscono l’esone 1, quindi possono ridurre i livelli sia della HTT a lunghezza intera che di HTT1a, tra cui la terapia genica AMT-130 di uniQure e il siRNA ALN-HTT02 di Alnylam Pharmaceuticals.

Questo studio suggerisce che abbassare solo la forma a lunghezza intera della HTT potrebbe non essere altrettanto vantaggioso e che anche ridurre HTT1a potrebbe essere importante. Poiché la proteina HTT normale ha funzioni importanti nelle cellule, le strategie che colpiscono specificamente HTT1a potrebbero rappresentare un approccio più sicuro ed efficiente.

Avvertenze importanti

Detto questo, ci sono alcune limitazioni importanti da notare in questo studio. Tutti questi dati provengono da topi che modellano la MH e hanno una ripetizione CAG molto lunga (~195). I topi sono un ottimo modello per gli scienziati per esplorare questo tipo di idee, ma non vivono neanche lontanamente quanto le persone e la maggior parte delle persone con MH ha in media circa 42 CAG, molto meno rispetto a questo sistema modello.

Tuttavia, i dati di questo studio saranno certamente una fonte di nuove idee per altri team. Continua a seguire HDBuzz per ulteriori ricerche in questo ambito.

Riassunto

• I ricercatori hanno creato un modello murino di MH che non produceva la stessa quantità del frammento HTT1a, ritenuto tossico nella MH.
• Riducendo i livelli del messaggio HTT1a, i ricercatori hanno osservato ritardi nella formazione di ammassi proteici tossici creati da HTT1a.
• In questi speciali topi carenti di HTT1a, l’attivazione o la disattivazione dei geni imitava più da vicino quella dei topi senza il gene della MH, e molti biomarcatori chiave sono tornati a livelli più vicini alla norma.
• Questi risultati forniscono la prova che HTT1a non è solo un sottoprodotto dell’espansione della MH, ma un fattore trainante della biologia della malattia.