Catturare una proteina gigante: cinque nuovi modi per afferrare l’huntingtina

La malattia di Huntington (MH) è causata da una modifica in un singolo gene noto come huntingtina. Questo gene contiene le istruzioni per produrre la proteina huntingtinaProteina huntingtina Proteina prodotta dal gene della MH.. Nonostante siano passati più di tre decenni dalla scoperta del gene della MH, gli scienziati stanno ancora cercando di capire esattamente cosa fa la proteina huntingtinaProteina huntingtina Proteina prodotta dal gene della MH. nelle cellule sane e come la versione MH causa la malattia.

Uno dei motivi per cui i progressi sono stati così lenti è che l’huntingtina è davvero difficile da studiare. È enorme, è ripiegata in modi complicati e gli strumenti che gli scienziati avevano non erano molto efficaci nell’afferrarla. In un nuovo studio, un team dal Canada e dal Giappone ha creato strumenti chimici completamente nuovi: minuscoli anelli di proteine chiamati macrociclici che possono afferrare l’huntingtina in cinque punti diversi. Quindi cosa hanno creato, cosa hanno scoperto e perché è importante per la MH?

Una proteina gigante difficile da vedere

Per capire la sfida, è utile immaginare l’huntingtina. Se la maggior parte delle proteine sono come normali elettrodomestici con un singolo compito, l’huntingtina è più simile a una cucina completa – costruita per supportare molti compiti diversi contemporaneamente.

È una catena molto lunga che si ripiega in due grandi masse collegate da un ponte flessibile. La modifica genetica che causa la MH si trova proprio all’inizio della proteina huntingtinaProteina huntingtina Proteina prodotta dal gene della MH., dove un breve segmento ripetuto (fatto di un elemento costitutivo chiamato glutammina) diventa anormalmente espanso. Le persone di solito hanno circa 20–35 di queste glutammine; nella MH, quel numero supera 35 e può raggiungere 50, 80 o più.

L’huntingtina ha molti compiti nel corpo. Aiuta a spostare le cose all’interno delle cellule, permette alle cellule di dividersi e pulisce i rifiuti. Ma non sappiamo esattamente come fa tutto questo.

Sappiamo una cosa con certezza: l’huntingtina ha un migliore amico chiamato HAP40, una proteina più piccola che si attacca ad essa, nota come partner di legame. Fino ad ora, HAP40 è stato l’unico partner di legame per il quale gli scienziati hanno un’immagine strutturale dettagliata. Individuare cos’altro fa l’huntingtina, e con chi, è stato limitato dalla mancanza di strumenti precisi e specifici per afferrarla.

Costruire rampini molecolari

Per creare strumenti migliori, gli scienziati hanno usato un sistema intelligente chiamato RaPID. Pensa a RaPID come a un’enorme festa di speed-dating tra minuscoli peptidi (piccoli pezzi di proteina) e l’huntingtina. Il team ha creato una collezione super-gigante di circa mille miliardi di peptidi diversi – cioè 1 seguito da 12 zeri!

Ogni peptide era piegato in un anello chiuso, un po’ come un elastico. Una forma ad anello o ripiegata può afferrare le cose più facilmente di un filamento dritto, come una graffetta piegata può agganciarsi agli oggetti, mentre un filo dritto scivola semplicemente via.

Ogni piccolo anello peptidico aveva il suo cartellino identificativo (fatto di DNA) attaccato ad esso. Quindi quando un anello era legato all’huntingtina, gli scienziati potevano leggere il suo cartellino e sapere esattamente quale peptide fosse. Hanno fatto diversi cicli di “pesca” per esporre la collezione di peptidi ad anello all’huntingtina, da sola o legata al suo amico HAP40. Hanno ristretto il pool solo ai più aderenti, e cinque peptidi ad anello sono emersi come i migliori leganti dell’huntingtina: HL2, HL5, HD4, HHL1 e HHD3.

Vedere esattamente dove si attacca ogni anello peptidico

Trovare anelli peptidici che si attaccano all’huntingtina è solo il primo passo. Successivamente, gli scienziati volevano sapere dove ciascuno afferrava l’huntingtina e quanto saldamente. Hanno usato tre metodi interessanti per capirlo:

• Test che misurano quanto fortemente gli anelli si tengono. Tutti e cinque gli anelli si tenevano davvero saldamente, abbastanza forte da essere strumenti utili, e forse anche un punto di partenza per potenziali farmaci che potrebbero pescare l’huntingtina tossica.
• Un metodo chiamato HDX-MS che mostra quali parti di una proteina vengono coperte quando un anello si attacca ad essa. Quando un anello si attacca all’huntingtina, scherma certi punti, lasciando un’”impronta” che aiuta gli scienziati a capire dove l’anello sta atterrando.
• Microscopia crioelettronica (cryo-EM), che è un microscopio super-potente che congela le proteine e crea immagini 3D così nitide che puoi vedere singoli atomi. (Sì, è fantastico come sembra.) Questo ha mostrato i contatti esatti che ogni peptide fa con la proteina huntingtinaProteina huntingtina Proteina prodotta dal gene della MH..

Ecco cosa hanno scoperto: due anelli (HL2 e HD4) afferrano l’huntingtina in punti lontani dal suo migliore amico HAP40.

Altri due anelli (HHL1 e HHD3) funzionano solo quando HAP40 è presente, infilandosi in una piccola tasca proprio tra i due amici e ripiegandosi in una forma simile al numero 8 per adattarsi.

L’ultimo anello (HL5) piace all’huntingtina solo quando è da sola, senza HAP40.

Ed ecco un punto importante: i cinque anelli afferravano l’huntingtina sana e l’huntingtina espansa altrettanto bene, il che è particolarmente utile in uno strumento progettato per studiare la proteina sia nelle cellule sane che in quelle malate.

Pescare gli amici dell’huntingtina in cellule reali

Gli strumenti utili devono funzionare nella vita reale, non solo nelle provette. Quindi gli scienziati hanno aggiunto un piccolo gancio (chiamato biotina) ai loro anelli peptidici, come un amo da pesca su una lenza. Gli scienziati hanno usato questi peptidi come esca per vedere se potevano catturare l’huntingtina in cellule umane coltivate in piastre, insieme a qualsiasi altra cosa vi fosse attaccata.

Un amico dell’huntingtina si è distinto molto al di sopra degli altri – HAP40. È apparso più e più volte, in ogni tipo di cellula che gli scienziati hanno provato, comprese le cellule simili al cervello che sono simili a quelle danneggiate nella MH. Anche nelle cellule con ripetizioni CAGRipetizioni CAG Tratto di DNA all' inizio del gene della MH, che contiene la sequenza CAG ripetuta molte volte, ed é lungo in maniera anomala nelle persone che svilupperanno la MH più lunghe (come Q45 o Q81), l’huntingtina aveva sempre HAP40 attaccato ad essa.

Sono state segnalate oltre 3.000 altre proteine che toccano l’huntingtina, ma questo esperimento mostra che HAP40 è quella che c’è davvero tutto il tempo. Questo suggerisce fortemente che l’huntingtina e HAP40 funzionano come un’unica unità la maggior parte del tempo, e la forma “reale” dell’huntingtina all’interno delle cellule potrebbe essere quasi sempre la coppia huntingtina–HAP40.

Perché questo è importante per la malattia di Huntington

Questi nuovi anelli non sono ancora farmaci, e gli scienziati stanno attenti a non dire che lo siano. Ma aprono molte porte interessanti.

Primo, funzionano altrettanto bene degli strumenti che gli scienziati usavano prima per attaccarsi e visualizzare l’huntingtina (chiamati anticorpi), ma sono più piccoli, più economici e possono afferrare molte parti diverse dell’huntingtina, non solo una. Sono anche abbastanza piccoli da poter entrare all’interno di cellule viventi e legarsi all’huntingtina, cosa che gli attuali anticorpi non possono fare. Questo permetterebbe agli scienziati di studiare l’huntingtina all’interno di cellule viventi in modi che sono attualmente impossibili.

Secondo, le immagini 3D ad alta risoluzione di questi anelli peptidici che si attaccano all’huntingtina sono come progetti per la progettazione di futuri farmaci. Per esempio, la forma a 8 mostra due piccole tasche nel punto di incontro huntingtina–HAP40 a cui i futuri farmaci potrebbero mirare, potenzialmente per “pescare” l’huntingtina tossica. Gli anelli potrebbero anche essere usati come parte “afferrante” di nuovi strumenti interessanti come PROTAC (strumenti che dicono alla cellula di buttare l’huntingtina nella spazzatura) o traccianti PET che potrebbero aiutare i medici a visualizzare l’huntingtina all’interno del cervello dei pazienti.

Terzo, il fatto che l’huntingtina sia quasi sempre con HAP40 all’interno delle cellule ridefinisce come dovremmo affrontarla. Se vogliamo capire cosa fa l’huntingtina, o come ripararla quando cambia e diventa tossica, probabilmente dobbiamo studiarla con HAP40, non da sola. Gli scienziati ora hanno un set di strumenti più precisi per indagare il mistero se l’huntingtina possa funzionare senza HAP40.

Guardando al futuro

Come tutta la scienza, questo articolo lascia molte domande. Gli anelli afferrano l’huntingtina sana e quella MH allo stesso modo, quindi non possono ancora dirci come mirare solo al tipo dannoso, che è qualcosa su cui i ricercatori stanno ancora lavorando.

I prossimi passi saranno testarli all’interno di animali viventi e riprogettarli per intrufolarsi nelle cellule. Sono stati trovati anche alcuni nuovi possibili partner di legame dell’huntingtina, come ACADVL e HEY1, per i quali sono necessari ulteriori test per confermare.

Questa ricerca fornisce alla comunità MH un set completamente nuovo di strumenti per una proteina che è stata davvero difficile da afferrare. Proprio come i microscopi straordinari hanno cambiato ciò che gli scienziati potevano vedere, questi minuscoli anelli peptidici promettono di trasformare ciò che possiamo chiedere sulla funzione dell’huntingtina, nella salute, nella malattia e nella ricerca di una cura.

Riassunto

• La malattia di Huntington (MH) è causata da una modifica che rende la proteina huntingtinaProteina huntingtina Proteina prodotta dal gene della MH. anormalmente lunga. Gli scienziati ancora non sanno completamente cosa fa questa proteina, perché è enorme e difficile da studiare con gli strumenti esistenti.
• Usando un sistema chiamato RaPID, il team ha testato circa mille miliardi di minuscoli frammenti proteici a forma di anello e ne ha identificati cinque che si attaccano saldamente e specificamente all’huntingtina, ciascuno in un punto diverso e ben definito.
• Un microscopio ad alta risoluzione ha mostrato esattamente come gli anelli si attaccano all’huntingtina. Due di essi si ripiegano persino in una forma interessante a 8 per adattarsi in una tasca tra l’huntingtina e il suo migliore amico HAP40.
• Quando gli anelli sono stati usati per “pescare” l’huntingtina da cellule umane reali, hanno quasi sempre catturato HAP40 insieme ad essa, indipendentemente dal tipo di cellula o dalla lunghezza della ripetizione CAG.
• Questi anelli sono relativamente economici, piccoli e flessibili, quindi potrebbero aiutare a creare futuri farmaci per la MH, strumenti di imaging cerebrale e nuovi modi per distruggere l’huntingtina dannosa.