Ridurre l’attività dei geni di riparazione del DNA rallenta la crescita delle ripetizioni della malattia di Huntington nei neuroni umani

Gli scienziati hanno utilizzato cellule di una persona affetta dalla malattia di Huntington (HD) per testare se l’abbassamento dei livelli dei geni di riparazione del DNA possa rallentare la crescita della nefasta ripetizione CAG. In queste cellule umane coltivate in laboratorio, la ripetizione è cresciuta più lentamente, suggerendo una potenziale strategia terapeutica per ritardare possibilmente l’insorgenza e la progressione della malattia, sebbene questo lavoro sia ancora in una fase iniziale.

Perché l’espansione delle ripetizioni CAG è importante nella HD

La HD è causata da un tratto anormalmente lungo di tre lettere del DNA, CAG, nel gene della huntingtina, spesso abbreviato in HTT. In genere, l’aumento della lunghezza della ripetizione CAG espansa è associato alla comparsa precoce dei sintomi della HD e a una progressione più rapida della malattia.

Ora sappiamo che per le persone con HD, la lunghezza CAG ereditata non è fissa per tutta la vita. In alcune cellule, specialmente in una regione del cervello situata circa al centro della testa, chiamata striato, la ripetizione CAG può allungarsi lentamente nel corso di molti anni. Questo processo è chiamato espansione somatica – espansione della ripetizione CAG nelle cellule “somatiche”, ovvero le cellule del corpo.

Le prove provenienti dal tessuto cerebrale umano e dagli animali che modellano la HD suggeriscono che questa crescita extra (espansione somatica) sia un fattore significativo di vulnerabilità di questi neuroni e un elemento principale nel guidare la progressione della malattia.

Riparazione del DNA: un fattore chiave dell’espansione CAG

Il nostro DNA viene costantemente danneggiato da fattori come l’esposizione ai raggi UV del sole, gli inquinanti ambientali e lo stress all’interno delle nostre cellule. Ma le cellule lavorano sempre per riparare questo danno nel loro DNA. Un sistema critico responsabile del mantenimento dell’integrità del materiale genetico è chiamato Mismatch Repair (MMR). Agisce come un correttore di bozze molecolare, individuando e correggendo piccoli errori per mantenere l’integrità genetica.

Tuttavia, la sequenza CAG altamente ripetitiva nel gene HTT è strutturalmente instabile e può formare forme insolite, come anse di DNA. Quando i componenti del sistema MMR incontrano queste strane strutture, si pensa che il processo di riparazione legga male il codice delle lettere del DNA, un po’ come se il sistema di correzione bozze accettasse dei refusi.

Questi errori di correzione da parte del sistema MMR possono portare all’incorporazione di ulteriori ripetizioni. In questo contesto, il sistema MMR, che normalmente protegge il codice genetico, diventa inavvertitamente un meccanismo principale che guida la dannosa espansione della ripetizione CAG.

Questo ruolo distruttivo del MMR nel contribuire alla HD è fortemente supportato da ricerche di lunga data. Studi genetici su larga scala, noti come Genome-Wide Association Studies (GWAS), condotti su persone con HD hanno confermato questo legame identificando differenze genetiche naturali (varianti) in diversi geni associati al MMR che modificano l’età in cui iniziano i sintomi.

Questi risultati hanno stabilito strategie terapeutiche convincenti. Se riuscissimo a ridurre in modo sicuro l’attività o i livelli di specifici geni MMR, potremmo essere in grado di rallentare efficacemente questo processo di espansione alla fonte.

Studiare la riparazione del mismatch nei neuroni umani HD

La maggior parte delle ricerche precedenti sulla riparazione del mismatch e sull’espansione CAG ha utilizzato topi che modellano la HD o cellule animali coltivate in piastra. In un recente studio guidato dalla dottoressa Sarah Tabrizi dell’University College di Londra, i ricercatori hanno utilizzato un sistema più direttamente rilevante per gli esseri umani.

Hanno iniziato con cellule della pelle donate da una bambina di sette anni con HD a esordio giovanile, che portava una ripetizione CAG espansa molto grande, superiore a 125, nel gene HTT. Gli scienziati hanno aggiunto molecole che hanno indotto le cellule della pelle a diventare cellule staminali, che sono capaci di auto-rinnovarsi e possono essere indirizzate a diventare vari tipi di cellule, comprese le cellule cerebrali.

Utilizzando protocolli che aggiungono diverse sostanze chimiche in momenti diversi, il team ha convertito le cellule staminali HD in cellule cerebrali arricchite di neuroni medi spinosi (MSN) che si trovano nello striato, una regione centrale del cervello pesantemente colpita dalla HD. Gli MSN sono cellule cerebrali specifiche note per essere particolarmente vulnerabili alla degenerazione nella HD. I ricercatori hanno misurato costantemente la lunghezza della ripetizione CAG sia nelle cellule staminali in divisione che in queste colture di cellule cerebrali per monitorare come la lunghezza della ripetizione cambiasse nel tempo.

Usare un variatore di luminosità molecolare

Per testare il ruolo della riparazione del mismatch, hanno utilizzato un potente strumento genetico chiamato interferenza CRISPR (CRISPRi). La CRISPRi agisce come un sistema molecolare per ridurre con precisione l’attività genica in singoli geni alla volta. Questo sistema è distinto dal normale editing genetico perché non taglia il DNA. Invece, utilizza una molecola che puoi immaginare come delle forbici molecolari, chiamata Cas9, che è fissata a livello molecolare a un variatore (dimmer) che abbassa efficacemente i livelli di una proteina bersaglio.

Il team ha utilizzato la CRISPRi per ridurre l’attività dei geni di riparazione del mismatch identificati negli studi genetici umani (GWAS). Hanno anche preso di mira i partner di quei geni MMR. I geni bersaglio includevano componenti delle famiglie di complessi multiproteici, la famiglia MutS (MSH2, MSH3, MSH6) e la famiglia MutL (MLH1, PMS1, PMS2, MLH3), insieme all’enzima DNA ligasi 1 (LIG1).

L’obiettivo dello studio era ridurre la loro attività a livelli realisticamente raggiungibili da farmaci terapeutici, piuttosto che eliminare completamente i geni. Questo approccio ha permesso loro di imitare in modo più realistico ciò che potrebbe essere sviluppato come trattamento o di imitare quelle varianti che si trovano naturalmente nelle persone con HD che hanno avuto un esordio dei sintomi più tardivo.

Successivamente i ricercatori hanno verificato che i loro esperimenti avessero avuto successo, eseguendo un altro esperimento chiamato “test di deficienza MMR”. Questo ha permesso loro di confermare che stavano effettivamente abbassando l’attività dei geni MMR bersaglio. Per fare ciò, hanno trattato le cellule con una sostanza chimica che imita il danno al DNA. Nelle cellule che hanno un sistema MMR perfettamente funzionante, questa sostanza chimica innesca tipicamente la morte cellulare. Ma se la funzione MMR è compromessa, le cellule riescono a sopravvivere.

L’esperimento ha confermato che il sistema MMR nelle cellule modificate era indebolito, mostrando una maggiore sopravvivenza cellulare rispetto ai controlli. È importante notare che la riduzione della funzione non era totale, in linea con l’obiettivo di una riduzione parziale e fornendo ai ricercatori un sistema in cui possono attenuare molecolarmente i livelli di questi geni per abbassarli invece di spegnerli.

L’impatto dell’attenuazione dei geni MMR sulle espansioni CAG

Infine, hanno osservato la velocità con cui la ripetizione CAG si espandeva sia nelle cellule staminali in divisione che nei neuroni striatali specializzati, confrontando i tassi di espansione con e senza la ridotta attività dei geni di riparazione del mismatch.

Nelle cellule staminali HD, la ripetizione CAG normalmente si allungava nel tempo, come previsto. Ma quando diversi geni di riparazione del mismatch sono stati attenuati con la CRISPRi, questa crescita è rallentata, suggerendo che la teoria del team fosse corretta! Gli effetti di rallentamento più forti sono stati osservati quando il team ha ridotto i principali componenti MutS (MSH2 e MSH3) e il componente principale MutL (MLH1). L’abbassamento di questi geni ha ridotto il tasso di espansione nelle cellule staminali in divisione tra il 60% e il 65%, mentre altri fattori MutL (PMS1, PMS2 e MLH3) hanno ridotto il tasso del 25-35%.

Ancora più importante, schemi simili sono stati osservati nelle colture di cellule cerebrali create dalle stesse cellule staminali HD. I ricercatori si sono concentrati strategicamente sui fattori MutL (PMS1, PMS2 e MLH3) nei neuroni, poiché i precedenti esperimenti sulle cellule staminali avevano escluso MSH6 e LIG1, e MSH2 presentava potenziali problemi di sicurezza dovuti al rischio di cancro. Inoltre, non hanno approfondito MSH3 poiché è già oggetto di ricerca come bersaglio terapeutico altrove.

Nei neuroni, con MLH1 attenuato, questa espansione è rallentata del 69%, e colpire PMS1, PMS2 o MLH3 ha rallentato l’espansione di oltre il 20% rispetto alle cellule di controllo. Ciò dimostra che la riparazione del mismatch rimane un fattore chiave dell’espansione somatica nei neuroni umani HD, non solo nelle cellule staminali in divisione o nei topi. Inoltre, dimostra che regolando i livelli di questi specifici geni MMR, i ricercatori potrebbero essere in grado di rallentare significativamente l’espansione somatica. Una prospettiva molto eccitante!

Cosa ha scoperto lo studio e cosa non mostra

In termini semplici, il messaggio centrale di questa ricerca è: nei neuroni umani coltivati in piastra creati da qualcuno con HD, attenuare i geni di riparazione del mismatch sembra essere sufficiente per rallentare la crescita della dannosa ripetizione CAG.

Questo lavoro è incoraggiante per l’idea di terapie “anti-espansione”. Allo stesso tempo, è importante essere chiari su ciò che questo studio non mostra. Tutto il lavoro è stato fatto in cellule in piastra, non in cervelli viventi. È stata utilizzata solo una linea di cellule staminali HD a esordio giovanile, con una ripetizione molto lunga.

Lo studio ha misurato la lunghezza della ripetizione CAG e la sua distribuzione. Non ha testato la sopravvivenza dei neuroni, il comportamento o la funzione cerebrale. Inoltre, non ha affrontato la sicurezza a lungo termine. I geni di riparazione del mismatch aiutano a proteggere tutti i tessuti dal cancro e modificare la loro attività nelle persone comporta rischi di causare il cancro, specialmente perché la perdita di geni come MSH2 e MLH1 è associata a un rischio significativamente aumentato di tumori del sistema nervoso, con anche PMS2 che comporta qualche rischio.

Ciò che il lavoro fornisce è una lista più realistica di geni di riparazione del mismatch che sembrano promettenti in un contesto di HD umana, evidenziando i membri della famiglia MutL, in particolare PMS1, come potenziali bersagli. Supporta l’idea che ridurre con attenzione l’attività di selezionati geni di riparazione del mismatch, probabilmente in misura moderata e possibilmente in combinazione, potrebbe essere un modo prezioso per rallentare l’espansione CAG. Queste informazioni potrebbero aiutare a guidare la progettazione e la priorità delle future terapie che mirano non solo a trattare i sintomi, ma a cambiare il ritmo stesso della malattia di Huntington.

Riassunto

• La riparazione del mismatch guida l’espansione CAG nei neuroni umani: utilizzando cellule cerebrali create da una persona con HD coltivate in una piastra di laboratorio, i ricercatori hanno confermato che il sistema di riparazione del mismatch guida la crescita della ripetizione CAG nei neuroni umani, non solo nei topi o nelle cellule in divisione.
• L’attenuazione dei geni di riparazione ha rallentato l’espansione: riducendo parzialmente l’attività di specifici geni di riparazione del mismatch, il team ha rallentato la crescita della ripetizione CAG fino al 69% nei neuroni, con i membri della famiglia MutL, in particolare PMS1, che emergono come potenziali bersagli terapeutici.
• Le scoperte genetiche hanno ora un supporto sperimentale nelle cellule umane: grandi studi genetici avevano precedentemente indicato i geni di riparazione del mismatch come modificatori dell’esordio della HD. Questo studio conferma il loro ruolo nei neuroni umani coltivati in laboratorio e aiuta a stabilire quali geni colpire. Il lavoro è stato condotto su una singola linea cellulare in piastra, ma rappresenta un passo importante verso terapie che mirano a rallentare l’espansione CAG.